虫儿飞飞
DHE染色对样本处理有哪些特殊要求？为何必须使用未固定的活细胞或新鲜冰冻切片？
DHE染色对样本处理有哪些特殊要求？为何必须使用未固定的活细胞或新鲜冰冻切片吗？
做DHE染色的人常碰到一个挠头事——明明按步骤来，结果要么荧光弱得像没染，要么全是杂信号，根本看不清活性氧在哪。其实问题大多出在样本处理上：DHE是个“挑活儿”的染料，对样本的“新鲜度”和“状态”比别的染色剂更敏感。很多人没摸透它的脾气，用了固定后的细胞或石蜡切片，反而把要测的东西“弄丢了”。咱们今天就掰扯清楚，DHE到底要啥样的样本，为啥非得用活细胞或新鲜冰冻切片。
DHE染色到底是测啥？先搞懂原理才不瞎忙
DHE的全名叫二氢乙啶，它测的是细胞内活性氧（ROS）的水平——ROS是细胞代谢或受刺激时产生的“带电子的小分子”，多了会伤细胞，少了也不正常。但DHE测ROS得靠“氧化发荧光”的本事：只有进入活细胞的DHE，才会被里面的超氧阴离子之类的ROS氧化成乙啶，嵌进DNA里发出红色荧光；要是细胞死了，细胞膜漏了，DHE要么进不去，要么氧化得乱七八糟，荧光要么没有要么不准。
我之前帮实验室新人调实验，他用了福尔马林固定的细胞，染出来整版红乎乎的，结果流式一测，荧光强度和ROS压根没关系——后来换成活细胞，荧光立马跟着ROS浓度变，才明白：DHE的“眼睛”只盯着活细胞里的ROS，死细胞的“噪音”会把它骗懵。
DHE染色的3个特殊要求：少一步都不行
要想DHE染得准，样本处理得守好“三条规矩”，每一条都戳中它的“软肋”：
1. 样本必须“鲜活”——固定会毁了检测信号
DHE依赖活细胞的完整细胞膜和正常代谢：活细胞的膜能控制DHE慢慢进去，里面的ROS能精准氧化它；可一旦用多聚甲醛、甲醇这类固定剂，细胞膜会被“焊死”，DHE要么挤不进去，要么进去后被固定剂里的自由基乱氧化，根本没法反映真实的ROS水平。
我见过有人图省事，把细胞固定后冻起来再染，结果荧光强度比活细胞低一半还多——固定相当于给DHE戴了副墨镜，让它看不见真正的ROS。
2. 操作得“快”——别让细胞“闷死”或“饿坏”
活细胞离体后代谢会变慢，ROS也会慢慢变少，所以处理得赶在“细胞还喘气”的时候：
- 贴壁细胞：消化下来后要赶紧离心（1000转/5分钟），用预温的培养基重悬，别让它们在管子里晾着；
- 悬浮细胞：收集后立即加DHE，整个过程别超过30分钟；
- 新鲜冰冻切片：从-80℃冰箱拿出来的切片，要立刻放到室温平衡1分钟（别太久，不然细胞脱水），然后马上加DHE孵育。
有次我做小鼠肝组织切片，拿出来磨蹭了10分钟才染，结果荧光比刚拿出来的弱了三分之一——细胞的“呼吸”停一分钟，ROS就少一点，DHE的信号也跟着弱。
3. 避光要“严”——荧光染料最怕光“偷能量”
DHE本身有点怕光，氧化后的乙啶更敏感，见光会分解，荧光一下就没了。所以：
- 配DHE母液时用棕色管（或铝箔包着），稀释好的工作液也要装在避光的EP管里；
- 孵育时把样本放在暗盒里（比如用黑布裹住培养皿），别让台灯、荧光灯照到；
- 染完冲洗用的PBS也要提前遮光，不然冲的时候光就把荧光“冲跑了”。
我之前没注意这点，孵育时开着显微镜灯，结果染出来的片子荧光淡得像没染——后来把灯关了用暗盒，荧光立马亮起来。
为啥非要用活细胞或新鲜冰冻切片？3个核心原因说透
很多人问：“我用石蜡切片不行吗？固定后不是更好保存？”其实不是不行，是石蜡切片会让DHE的检测结果“失真”，具体看这几个关键：
1. 活细胞的“天然环境”是DHE工作的前提
活细胞的膜电位稳定（能控制物质进出）、酶系统正常（ROS的生成和清除保持平衡），DHE进去后能“精准定位”到ROS多的地方（比如线粒体附近）。而固定后的细胞，膜电位没了，酶也失活了，ROS要么扩散得到处都是，要么被固定剂破坏，DHE氧化后的荧光位置根本不对——就像你想拍一朵花，却把花摘下来泡在水里，拍出来的样子肯定不是它在枝头上的样子。
2. 固定会“杀死”DHE的“识别能力”
固定剂的原理是让蛋白质变性、交联，把细胞“定”在某个状态。可DHE要发挥作用，得靠活细胞里的还原性环境（比如谷胱甘肽之类的物质能调节ROS浓度）。固定后，这些还原性物质要么被破坏，要么流失，ROS的浓度变了，DHE氧化后的荧光强度也跟着乱变——比如原本ROS高的细胞，固定后可能荧光反而低，因为还原性物质没了，ROS被“中和”了。
3. 新鲜冰冻切片保留了“最接近活组织的结构”
石蜡切片需要脱水、透明、浸蜡，这几个步骤会把细胞里的水分抽干，把脂质溶解掉，细胞结构皱缩得厉害，连细胞核都变形了。而新鲜冰冻切片是用OCT包埋后直接冻在-80℃，切片时不用脱水，细胞形态和活组织几乎一样，ROS的分布位置也能保留下来。
我做过对比：同一块小鼠脑组织的石蜡切片和新鲜冰冻切片，用DHE染完，冰冻切片的海马区荧光明显比石蜡切片亮，而且能看清神经元周围的ROS分布——石蜡切片里的细胞都缩成一团，荧光全糊在一起，根本分不出哪块是神经元的。
常见误区vs正确做法：一张表帮你避坑
| 错误做法 | 问题根源 | 正确做法 |
|-------------------------|---------------------------------------|-------------------------------------------|
| 用多聚甲醛固定细胞后染DHE | 固定破坏膜完整性，DHE无法精准氧化 | 直接用活细胞，处理后立即染 |
| 石蜡切片做DHE染色 | 脱水浸蜡破坏细胞结构，ROS分布丢失 | 用新鲜冰冻切片（-80℃保存不超过1个月） |
| 染完后长时间暴露在光下 | 荧光染料分解，信号减弱甚至消失 | 全程避光（配液、孵育、冲洗都用暗盒/遮光） |
| 样本处理超过1小时才染 | 细胞代谢减慢，ROS减少 | 活细胞30分钟内、冰冻切片10分钟内完成染液孵育 |
问答时间：解决你最关心的细节问题
问：活细胞染DHE时要不要加血清？
答：要加！血清里有生长因子和营养，能维持细胞活性。但血清里的蛋白质可能会吸附DHE，所以染液里的血清浓度别太高（建议≤2%），不然荧光会弱。我一般用无血清培养基稀释DHE，这样既保活细胞，又不影响染料结合。
问：新鲜冰冻切片能保存多久？
答：最好1个月内用完，-80℃密封保存（别反复冻融）。我试过存了2个月的切片，染出来荧光强度降了40%，因为冰晶慢慢破坏了细胞结构，ROS也流失了。
问：悬浮细胞怎么保证活性？
答：收集后立刻用预温的培养基重悬，离心速度别太高（1000转就行，太快会压碎细胞），染的时候放在37℃摇床（低速），模拟体内的温度环境，这样细胞活性能保持更久。
做DHE染色就像“跟活细胞谈恋爱”——你得顺着它的性子来，给它最鲜活的样本、最快的操作、最暗的环境，它才会把ROS的真实情况告诉你。要是硬用固定后的样本“逼”它说话，得到的肯定是假话。我做了这么多年实验，最大的体会就是：染色的本质是“还原样本本来的样子”，你对样本越温柔，结果越诚实。下次再做DHE，不妨慢一点、细一点，说不定就能看到以前没发现的ROS分布规律。
【分析完毕】